بیولوژی

یا واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction)، تکنیکی است که با استفاده از آن می توان در مدت زمان کوتاهی قطعه خاصی از مولکول DNA را در شرایط آزمایشگاهی میلیون ها بار تکثیر نمود. این قطعه DNA ممکن است یک ژن، بخشی از یک کروموزوم یا بخش هایی از ژنوم یک موجود باشد. البته در تکثیر DNA با روش PCR محدودیت هایی نیز وجود دارد که مهمترین آنها اندازه قطعات قابل تکثیر می باشد به طوری که حداکثر اندازه قطعه هایی که با روش PCR معمولی تکثیر می گردد، 5 هزار نوکلئوتید (kb 5) و در روش های بهینه شده تا 20 هزار نوکلئوتید (kb 20) می باشد.
با این تعریف، PCR همانند یک دستگاه فتوکپی عمل می کند که بوسیله آن می توان صفحاتی از کتاب ژنوم هر موجود را به تعداد دلخواه و مشابه نسخه اصلی (البته در مواردی همراه با خطاهای جزئی) تکثیر نمود.

اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA پلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها جهت تکثیر قطعات DNA استفاده می شود.

مخترع واکنش PCR کَری مولیس (Kary Mullis) می باشد که در سال 1983 این روش را جهت تکثیر DNA معرفی کرد. قبل از این کشف، ساخت قطعات DNA با روش های کند و پر هزینه شیمیایی انجام می گرفت. به دلیل اهمیت این اختراع، کاربردهای فراوان و نقش ارزنده آن در پیشرفت علم ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، وی جایزه نوبل شیمی را در سال 1993 دریافت کرد.

واکنش PCR به طور روزمره در اکثر آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می شود و در موارد بسیاری مثل شناسایی و جداسازی ژن ها، کلونینگ، طبقه بندی و شناسایی موجودات زنده، تشخیص بیماری های ژنتیکی و حتی پرونده های جنایی و تعیین هویت کاربرد دارد. در حال حاضر و نزدیک به 30 سال پس از کشف PCR، تحقیقات ژنتیک مولکولی بدون استفاده از این تکنیک قابل تصور نیست.

سازوکار (برنامه) واکنش PCR
اساس واکنش PCR جهت تکثیر توالی DNA دو رشته ای، تغییرات دمایی می باشد. در ابتدا پیوندهای هیدروژنی دو رشته توالی DNA با حرارت (94-95 درجه سلسیوس) شکسته و دو رشته از یکدیگر جدا می شوند. سپس دمای واکنش پایین آورده می شود (معمولاً 50 تا 60 درجه سلسیوس). در این مرحله، دو قطعه کوتاه DNA تک رشته ای (معمولاً بین 18 تا 30 نوکلئوتید) که دقیقاً مشابه دو طرف قطعه DNA مورد نظر برای تکثیر طراحی و ساخته شده اند (با نام پرایمر یا آغازگر)، به توالی های مکمل خود در دو رشته باز شده DNA متصل می گردند. این دو قطعه انتهای 3’ آزاد جهت فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می نماید، کاری که در همانند سازی در موجودات زنده توسط آنزیم پریماز و توالی اولیه ساخته شده توسط آن انجام می گیرد. در مرحله بعد، دمای واکنش تا 72 درجه سلسیوس (دمای مناسب آنزیم Taq polymerase) افزایش یافته و عمل تکثیر قطعه DNA مورد نظر بین دو پرایمر با استفاده از نوکلئوتیدهای موجود، توسط آنزیم Taq polymerase مقاوم به حرارت انجام می پذیرد.

مرحله اول: واسرشت سازی (Denaturation30 تا 60 ثانیه

عمل انجام شده در این مرحله: جدا شدن دو رشته DNA

مرحله دوم: اتصال (Annealing30 تا 60 ثانیه

عمل انجام شده در این مرحله: اتصال پرایمرها به نواحی مکمل روی DNA و تعیین محدوده تکثیر قطعه DNA

مرحله سوم: گسترش (Extension یا Elongationبه ازای هر 1000 نوکلئوتید طول قطعه 60 ثانیه

عمل انجام شده در این مرحله: تکثیر قطعه DNA مورد نظر

این 3 مرحله بین 25 تا 40 بار تکرار می شود که به آن چرخه های PCR می گویند.

اجزا واکنش PCR
در یک واکنش PCR از نمونه DNA، آنزیم Taq polymerase، پرایمرها، بافر، یون منیزیم، نوکلئوتیدها و آب حضور استفاده می شود. توضیحات مربوط به هر یک از این اجزا در ادامه ارائه شده است:

- نمونه DNA (الگو)
تکثیر از روی نمونه DNA انجام می شود. این نمونه می تواند، قطعه ای DNA، محصول استخراج DNA ژنومی، DNA پلاسمیدی یا حتی محصول PCR دیگری باشد. معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل و EDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد. همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد.

- آنزیم Taq polymerase
این آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد. به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در 50 میکرو لیتر از واکنش PCR استفاده می شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت کننده PCR باشد، می توان این مقدار را دو تا سه برابر افزایش داد ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد. گرچه دمای مناسب برای این آنزیم 72 درجه سلسیوس می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به تکثیر می باشد برای جلوگیری از اتصال قطعات پرایمر به نقاط دیگری روی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیر اختصاصی، توصیه می شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد.

- نوکلئوتید ها
چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می باشند که به عنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می شوند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود. به طور مثال، در یک واکنش 50 میکرو لیتری PCR باید 5 میکرو لیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

- بافر
مهمترین نقش بافر PCR تنظیم pH مناسب واکنش PCR و آنزیم Taq polymerase می باشد. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA الگو (نمونه) کمک می کند.

- یون منیزیم
یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد. انواع مختلف آنزیم DNA polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. برای تکثیر با Taq polymerase این یون عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم در واکنش PCR استفاده می شود. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می شود.

غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است. غلظت بالاتر از این مقدار باعث تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیر اختصاصی) شده و غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.

- پرایمرها
غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. طراحی پرایمر نیازمند دقت فراوانی است و مرحله بسیار مهمی در امکان پذیر شدن و صحت تکثیر قطعه مورد نظر دارد. دمای مرحله اتصال در برنامه PCR به توالی پرایمرها ارتباط دارد.

وسایل مورد نیاز برای واکنش PCR
حداقل وسایل مورد نیاز برای انجام واکنش PCR، دستگاه ترموسایکلر (ایجاد کننده چرخه های دمایی)، میکرو پیپت، ظرف یخ و وسایل یکبار مصرفی مانند تیپ (جز پلاستیکی که برای کشیدن محلول به میکرو پیپت متصل می شود) و ویال (لوله های درب دار کوچک، در دو اندازه بر اساس گنجایش آنها یعنی 200 و 500 میکرو لیتر، که واکنش PCR در آنها انجام می شود) و ظروف نگهداری آنها می باشد.

ویال

دستگاه ترموسایکلر برای ایجاد دماهای مختلف در مدت زمان مورد نظر، قابل برنامه ریزی می باشد. قبل از تولید این دستگاه، دانشمندان برای انجام PCR از سه حمام آب گرم با دماهای مختلف استفاده می کردند که کار بسیار پر زحمتی بود.

دستگاه ترموسایکلر (PCR)

میکرو پیپت برای برداشتن مقادیر اندک مورد نیاز برای واکنش PCR در مقیاس میکرو لیتر استفاده می شود. بر روی این دستگاه که کار کردن با آن بسیار راحت است، تیپ های یک بار مصرف قرار داده می شود و بدین وسیله حجم مورد نظر از آن برداشته و به واکنش PCR افزوده می شود.



.

نوشته شده در سه شنبه 18 مهر1391ساعت 21:40 توسط م.پ|

قدمه اي بر فلوسايتومتري
برداشتي از كتاب فلوسايتومتري (اصول و روش‌ها)

فلوسايتومتري روش دستگاهي بسيار سريع و قدرتمندي است كه براي شناسايي ذرات (سلول‌ها) و ارزيابي خصوصيّات آنها به كار مي‌رود. ذرات مورد آزمايش به صورت معلق در مايع با سرعتي حدود 5 تا 50 متر در ثانيه از ميان منفذي باريك و از مقابل پرتوي باريك از نور ليزر عبور مي‌كنند بدين ترتيب امكان جمع‌آوري اطلاعات مربوط به 5000 تا 50000 سلول در هر ثانيه فراهم مي‌شود. غالباً حجم مورد نياز از نمونه مورد آزمايش نيز خيلي كم و حدود 100 ميكروليتر مي‌باشد. در مورد دقت آن نيز بايد گفت كه قادر است تعداد 1 سلول سرطاني در ميان 10000 تا 100000 سلول عادي موجود در نمونة مغز استخوان را شناسايي كند. فلوسايتومتري در بخش‌هاي تحقيقاتي و در آزمايشگاه‌هاي تشخيصي كاربرد وسيعي دارد و براي تشخيص بيماري‌ها، تعيين پيش آگهي و هم براي ارزيابي درمان بدخيمي‌ها كاربرد دارد.

اين روش بر خصوصيات پراكنده سازي نور توسط سلول‌ها (شكل 1) و نيز بر نشر فلورسانس از آنها (شكل 2) استوار است. نشر فلورسانس مي‌تواند با استفاده مستقيم از مواد رنگ‌كننده فلورسنت حاصل مي‌شود (مثل رنگ كننده‌هاي DNA يا RNA كه هم خصوصيت فلورسانس بودن را دارا هستند و هم خود انتخاب مي‌كنند كه به كدام جزء سلولي متصل شوند) يا تركيبي از رنگ فلورسنت با آنتي‌بادي‌هاي مونوكلونال تحت نام عمومي كونژوگه مورد استفاده قرار مي‌گيرد. در اين حالت انتخاب محل اتصال به سلول، توسط جزء آنتي‌بادي موجود در كونژوگه صورت مي‌گيرد و اين آنتي‌بادي است كه به صورت كاملا اختصاصي آنتي‌ژن هدف را بر روي سلول يا در داخل آن شناسايي كرده و به آن متصل مي‌شود و جزء فلورسنت موجود در كونژوگه ابزاري براي رديابي محل و ميزان آنتي‌بادي‌هاي متصل شده به هدف مي‌باشد.

اگر چه سلول‌ها بخودي‌خود داراي فلورسانس اندكي در برخي طول موج‌ها هستند اما بدون بكارگيري نور تهييج كننده كه غالباً ليزر مي‌باشد هيچ سيگنالي توليد و به ردياب‌هاي دستگاه ارسال نخواهد شد. سيگنال‌هاي رديابي شده توسط دستگاه يا از منشاء نور ليزر دستگاه مي‌باشد كه پس از برخورد به سلول در جهات مستقيم (forward scatter) يا عمود بر محور تابش ليزر (side scatter) پراكنده شده و به ردياب‌ها مي‌رسد و يا از منشاء فلوروكروم متصل به سطح ذره مي‌باشد. فلوروكروم‌هاي متصل شده به سطح يا داخل سلول بر اثر تابش نور ليزر تهييج شده و انرژي نور تابيده شده را جذب كرده و سپس در طول موج ديگري به صورت تابش فلورسانس آزاد مي‌سازند.

شكل 1

شكل 2

سلول‌ها از اجزاء مختلفي مثل غشاء سيتوپلاسمي، غشاء هسته‌اي، هسته و سيتوپلاسم تشكيل مي‌شود و تقريبا همه مولكول‌هاي موجود در قسمت‌هاي مختلف سلول را مي‌توان با استفاده از فلوسايتومتري رديابي و تعيين مقدار نمود. معمولاً مولكول‌هاي سطحي موجود در غشاء سيتوپلاسمي براحتي در دسترس آنتي‌بادي قرار مي‌گيرند ولي براي رسيدن آنتي‌بادي يا مادة فلورسانس به مولكول‌هاي دروني سلول روش‌هاي مطمئن و موثري لازم است.

هر سلولي بر حسب نوع و تخصصي كه به عهده دارد مولكول‌هاي مختص به خود را بيان مي‌كند، بدين معني كه همة ژن‌ها در همة سلول‌ها بيان نمي‌شوند بلكه برحسب وظيفه‌اي كه در طي تمايز بر عهدة سلول گذاشته شده است و بر حسب محيطي كه در آن قرار مي‌گيرد هر سلولي خود انتخاب مي‌كند كه در پاسخ به شرايط محيطي كدام ژن را فعال سازد. بنابر اين رديابي پروتئين‌هاي سلولي حاصل از بيان ژن‌ها هم در سطح و هم در درون سلول مي‌تواند وسيله‌اي بسيار مفيد براي شناسايي سلول باشد.

مولكول‌هاي سطحي سلول‌ها تحت نام عمومي CD كه مخفف Cluster Differentiation مي‌باشد شناخته مي‌شوند و براي رديابي آنها از آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال كونژوگه با فلوروكروم استفاده مي‌شود. مثلا ماركرهاي سطحي سلولهاي NK عبارتند از CD16 و CD56 كه آنتي‌بادي‌هايي با همين نام قادرند اين مولكول‌ها را در سطح سلول شناسايي نمايند. اغلب لفظ آنتي‌بادي در گفتار يا نوشتار حذف مي‌شود مثلاً كونژوگه CD16 همان آنتي‌بادي شناسايي كننده CD16 مي‌باشد كه متصل به فلوروكروم است. يا كونژوگه CD34 اشاره به آنتي‌بادي شناسايي كنندة CD34 دارد كه با فلوروكروم مناسبي كونژوگه شده است (CD34 ماركر اختصاصي سلول‌هاي ريشه‌اي تمايز نيافته مغز استخوان مي‌باشد).

با استفاده از فلوسايتومتري محصولات پروتئيني ژن‌ها در داخل سلول نيز قابل رديابي هستند و نامگذاري آنتي‌بادي‌هاي مورد استفاده براساس نام پروتئين مورد نظر صورت مي‌گيرد. مثلاً پروتئين Zap-70 ساروگيت ماركر براي موتاسيون‌هاي ناحيه متغير زنجيره سنگين ايمونوگلوبولين مي‌باشد و در تعيين زير گروه‌هاي CLL اهميت دارد و توسط آنتي بادي با همين نام قابل شناسايي است.

فلوسايتومترهاي اوليه قادر بودند فقط يك يا دو رنگ فلورسانس را تجزيه و تحليل كنند اما امروزه دستگاه‌هايي عرضه شده‌اند كه قادرند يازده رنگ فلورسانس را به طور هم‌زمان رديابي و تجزيه و تحليل كنند. اساس و نحوة كار فلوسايتومتر بحث پايه‌اي براي درك روش‌هاي مختلف فلوسايتومتري است.

براي انجام فلوسايتومتري لازم است كه ابتدا سلول‌ها با فلوروكروم‌ها نشاندار شوند. از طرفي براي نشاندار كردن اجزاء داخلي سلول بايد اقدامات خاصي را انجام داد تا آنها در دسترس آنتي‌بادي يا ماده فلورسنت قرار گيرند روش‌هاي رنگ‌آميزي با فلوروكروم‌ها و استفاده از مواد نفوذپذير كننده متنوع براي نفوذپذير كردن سلول‌ها خود بحث ديگري است كه بايد جداگانه به آن پرداخته شود.

تعداد فلوروكروم‌هاي مورد استفاده براي فلوسايتومتري در طي ساليان متمادي مرتباً افزايش يافته است و اين احتمال وجود دارد كه در آينده، تعداد فلوروكروم‌هاي مورد استفاده براي آناليز سلول‌ها بيش از اين نيز افزايش يابد. شناخت انواع فلوروكروم‌ها و آگاهي از مزيت‌ها و معايب هر كدام تنها راه استفاده بهينه از آنها براي دستيابي به مقاصد علمي تحقيقاتي است.

براي انجام هر نوع فلوسايتومتري ابتدا بايد سلول‌ها را آماده كرد به طوري كه سلول‌ها به صورت تكي در آمده و در محيط مناسبي معلق شده باشند. بعضاً يك مرحله تخليص براي بالا بردن غلظت سلول‌هاي مورد نظر در نمونه ضرورت پيدا مي‌كند روش‌هاي مختلفي براي تهيه، تخليص و آماده سازي سلول وجود دارند و روش انتخاب شده به نوع سلول مورد ارزيابي بستگي دارد.

پس از تهيه سوسپانسيون مناسب، سلول‌ها بايد با مواد فلورسانس رنگ شوند و يا با آنتي‌بادي‌هاي كونژوگه با فلوروكروم نشاندار شوند. روش نشانداركردن تحت تاثير فاكتورهاي زيادي قرار مي‌گيرد از جمله: ميزان اختصاصي بودن آنتي‌بادي و غلظت آنتي‌ژن در سطح يا داخل سلول، مناسب بودن غلظت آنتی بادی مورد استفاده و به کار بردن كنترل‌هاي مثبت و منفي مناسب در آناليز سلول‌ها.

داشتن برنامه‌هاي كنترل كيفي براي روش‌ها و تجهيزات در هر نوع فلوسايتومتري ضروري بوده و يك نياز اساسي محسوب مي‌گردد. اين برنامه‌ها براي اطمينان از كيفيت نتايج بدست آمده به كار برده مي‌شوند. همچنين برنامه‌هاي كنترل كيفي بايستي مرتباً و در حد كفايت انجام شوند تا تشخيص نقاط اشكال به آساني ممكن گردد. بدين منظور، برنامة كنترل كيفي در هر دو زمينة، كنترل كيفي داخلي و روش‌هاي ارزيابي كيفي خارجي، بايد به اجرا گذاشته شوند.

در فلوسايتومتري طي دو مرحلة جمع‌آوري اطلاعات و مرحلة آناليز اطلاعات امكان خطا وجود دارد كه با به كارگيري روش صحيح تهية نمونه سلولي و تنظيم دقيق دستگاه مي‌توان از خطاهاي مربوط به مرحلة جمع‌آوري اطلاعات جلوگيري كرد اما توانايي اپراتور در طراحي صحيح آزمايش، تنها جنبه‌اي از كسب اطلاعات است كه براي آن روش‌هاي كنترل خطا وجود ندارد. بدين معني كه انتخاب آنتي‌بادي مناسب و انتخاب فلوروكروم متناسب با غلظت و موقعيت آنتي‌ژن نيازمند تجربيات و اطلاعاتي است كه بايد توسط محقق كسب شوند.

آپوپتوز يكي از شكل‌هاي مرگ سلول مي‌باشد كه از نظر بيولوژي اهميت زيادي دارد و به همين دليل رديابي و اندازه‌گيري آپوپتوز در تحقيقات و موارد باليني اهميت پيدا مي‌كند. سلول‌هاي در حال آپوپتوز نشانه‌هاي زيادي دارند كه قابل اندازه‌گيري با فلوسايتومتري مي‌باشند اين نشانه‌ها عبارتند از تغييرات در غشاء پلاسمائي سلول، تغييرات در نفوذپذيري غشاء پلاسمائي، تغييرات در نفوذپذيري غشاء ميتوكندري، فعال‌سازي كاسپازها و شكستگي‌هاي DNA سلولي. شناسايي هر يك از اين تغييرات به تنهايي يا تركيبي از آنها به وسيلة فلوسايتومتري، امكان شناسايي و اندازه‌گيري سلول‌هاي آپوپتوتيك را از ميان مخلوطي از سلول‌هاي ديگر فراهم مي‌كند همچنين اطلاعات با ارزشي در بارة مسير مولكولي مرگ سلول‌ها به دست مي‌آيد.

دسترسي به رنگ‌های فلورسنتي که به صورت خطی و متناسب با غلظت به DNA سلولي متصل می‌شوند فلوسایتومتری را برای آنالیزDNA توانمند ساخته است. امروزه تعیین کمی مقدار DNA، شناسایی سلول‌های دیپلوئید نرمال در حالت استراحت، شناسايي سلول‌هايي كه به طور فعال DNA سنتز مي‌كنند و شناسايي سلول‌هايي كه در مرحلة پیش میتوز و یا میتوز هستند توسط فلوسايتومتر امكان پذير شده است. هنگامي كه فازهای مختلف چرخة زندگي سلول‌ها مشخص شدند، مي‌توان با توام‌كردن روش‌هاي رديابي پروتئین‌های مؤثر در چرخة سلولی به وسيلة آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي و روش تعيين مقدار DNA بيان پروتئين‌ها را در فازهاي مختلف زندگي سلول‌ها بررسي كرد. اضافه‌نمودن آنالوگ تیمیدین يا بروموداکسی یوریدین به محيط كشت سلولي امكان شناسایی سلول‌هایی را فراهم مي‌كند که فعالانه در حال سنتز DNA هستند. با استفاده از روش تعيين مقدار DNA همچنين مي‌توان تعداد کروموزوم‌ها (هنجار یا ناهنجار) را مشخص كرد. سلول‌هايي كه به حالت پلوئیدی (برای مثال در مگاکاریوسیت‌ها) و يا آناپلوئیدی (برای مثال در بیماری‌های بدخیم) مي‌باشند نيز با اين روش قابل شناسايي هستند.

روش فلوسايتومتري در ساية افزايش روزافزون تعداد آنتي‌بادي‌ها، تترامرها و رنگ‌هاي توليد شده براي استفاده در ارزيابي فعاليت سلول‌ها به عنوان يك ابزار مهم در مطالعة سلول‌هاي سيستم ايمني در آمده است. فلوسايتومتري چند رنگي اين امكان را فراهم آورده است كه انواع سلول‌هاي موجود در نمونة خون يا سلول‌هاي كشت شده به تفكيك مورد ارزيابي قرار گيرند. سلول‌هاي تحت مطالعه با استفاده از آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي معرف زير گروه‌هاي سلولي، شناسايي مي‌شوند و خصوصيات رفتاري آنها نيز با استفاده از آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي (مثلاً ضد سايتوكين) و يا رنگ‌هاي ارزيابي كنندة حيات سلولي تعيين مي‌شوند. با استفادة هم‌زمان از دو روش آناليز سلولي و جداساز سلولي (cell sorter) امكان مطالعة بيشتر و كشت سلول‌هاي كاملاً شناخته شده از نظر فنوتايپي يا رفتاري فراهم مي‌گردد.

در حضور يون‌هاي کلسیم خصوصیات طیفی برخي از رنگ‌های فلورسنت تغییر می‌یابد. از اين رنگ‌ها براي اندازه‌گيري تغييرات غلظت كلسيم اجزاء سلولي در هنگامي ‌که سلول‌ها بوسیله انواع محرک‌ها تحریک می‌شوند استفاده مي‌شود.

بيشترين مورد استفاده از فلوسایتومتری ارزيابي آنتی‌ژن‌هاي سطحی بیان‌شده بر روی سلول‌ها مي‌باشد. اما علاوه بر آن سلول‌ها ممکن است با روش‌هاي مختلف برای اندازه‌گیری خصوصیات عملکردی بوسیلة فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گیرند. مي‌توان تغییرات زماني بیان گیرنده‌ها را تعيين كرد يا برهمكنش یک نوع سلول را با سلول دیگر اندازه‌گیری نمود. بعلاوه، امكان ارزيابي تغییرات در فعالیت آنزیم‌ها و پتانسیل غشایی وجود دارد. همچنین مي‌توان آزمایشاتی برای نشان دادن فاگوسیتوز و آزادسازی مولکول‌های فعال زيستي (bioactive) انجام داد.

روش جداسازي سلول‌ها با استفاده از خصوصيات فلورسانس آنها توسط ايمونولوژيست‌هايي ابداع شد كه تلاش مي‌كردند جمعيت‌هاي خالص سلول‌ها را از نمونه‌هاي مختلط تهيه كرده و پس از تكثير آنها در محيط كشت سلولي، نقش مجزاي هر سلول را در سيستم ايمني بررسي نمايند. روشي كه آنها به كار بردند Fluorescence Activated Cell Sorting يا به طور خلاصه FACS ناميده شد. جداسازهاي جرياني (flow sorter) وسايلي ضروري و پرطرفدار در علوم بيولوژيكي و علوم ديگر هستند. كارآيي اصلي اين جداسازها، چنانچه از نامشان بر مي‌آيد، جدا كردن جمعيت‌هاي سلولي دلخواه از ميان جمعيتي هتروژن از سلول‌ها براي مطالعة بيشتر مي‌باشد. بطور كلي اگر سلول يا ذره‌اي داراي خصوصيات منحصر به فردي از نظر فيزيكي يا شيميايي باشد با استفاده از آن خصوصيات مي‌توان براحتي آن را شناسايي كرده و توسط flow sorter از ديگر سلول‌هاي همراه جدا كرد.

مبحث مهم ديگر نرم افزارهاي مورد استفاده در فلوسايتومتري هستند. در اوايل، دستگاه‌هاي فلوسايتومتر اطلاعات سلولي جمع‌آوري شده توسط دستگاه را با فرمت خاصي ذخيره مي‌كردند كه استفاده مجدد از اطلاعات ذخيره شده در كامپيوترهاي معمولي (PC) غيرممكن مي‌شد، اما امروزه نسل سوم استانداردهاي فايل فلوسايتومتري (FCS3) تنظيم و تصويب شده است و رعايت اين استانداردها توسط توليد كنندگان دستگاه‌ها سبب شده است تا فايل‌هاي اطلاعات ذخيره شدة فلوسايتومتري كاربرد عمومي‌تري پيدا كند. نرم افزارهاي مورد استفاده مي‌توانند براي جمع‌آوري اطلاعات و پردازش آنها، ترسيم نمودارهاي يك، دو يا سه بعدي از اطلاعات و يا براي انجام محاسبات رياضي و آماري بر روي اطلاعات به كار برده شوند. معرفي انواع نرم افزارهاي رايج براي باز كردن و مديريت فايل‌هاي فلوسايتومتري و محاسن و محدوديت‌هاي هر كدام نيازمند مجالي ديگر است.

اگر چه اين مقدمه خيلي حجيم و طولاني شد اما براي ذكر عناوين و موضوعات مطرح در فلوسايتومتري ناگزير از آن بودم اميد است كه بتوانم در روزهاي آينده عناوين مطرح شده را با جزئيات بيشتري براي استفاده خوانندگان عزيز ارائه نمايم. مسلماً آگاهي از نقطه نظرات خوانندگان راهگشاي مسير ارائه اين اطلاعات خواهد بود

نوشته شده در سه شنبه 18 مهر1391ساعت 21:38 توسط م.پ|

با عرض سلام خدمت همکاران محترم و خسته نباشید شروع سال جدید را تبریک عرض می کنم و امیدوارم سالی پر از فعالیت مفید داشته باشید و نتیجه کارهایتان را ببینید

گروه های اموزشی قرچک


نوشته شده در سه شنبه 18 مهر1391ساعت 21:36 توسط م.پ|



قالب جدید وبلاگ پیچك دات نت